Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал

Андрей Брюховецкий

Монография посвящена гемопоэтической стволовой клетке (ГСК) в диагностике и комплексном лечении фатальных заболеваний. Изучена поверхность ГСК и потенциал ее использования в ранней молекулярно-биологической диагностике ряда смертельных заболеваний, а также в оценке возрастной «изношенности» тканей. Разработана инновационная технология биомедицинского клеточного продукта на основе ГСК для лечения рака и нейродегенеративных, аутоиммунных и геронтологических болезней, а также для продления жизни.

Глава 4. Фундаментальные аспекты проблемы: взаимодействие гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток in vitro (соавт. д.м. н.

И.С. Брюховецкий)

Одним из ключевых этапов эволюции многоклеточных организмов стало появление способности к специфическому координированному межклеточному взаимодействию, что сделало возможным согласованную регуляцию метаболизма, дифференциацию клеток и проявление физиологических функций дифференцированных клеток (акад. М. А. Пальцев, 2003). Вектор взаимодействия стволовой и дифференцированной клеток определяется локальными микроусловиями среды, однако только в патологии и клинике можно понять всю глубину адаптивных возможностей организма. В этой главе мы остановимся на закономерностях межклеточного взаимодействия ГСК с нормальными и патологически измененными, а именно опухолевыми клетками.

Закономерности миграции гемопоэтических стволовых клеток к опухолевым клеткам различных линий in vitro

Для обоснования феномена направленной миграции ГСК в неопластический очаг и выявления некоторых механизмов реализации этого феномена был выполнен эксперимент in vitro, который проходил в 2 этапа:

1. исследование миграции стволовых клеток в сочетанных культурах с клетками различных линий;

2. исследование миграции стволовых клеток человека в сокультурах с клетками злокачественных опухолей различных типов.

Использованы дермальные фибробласты человека (ATCC® PCS-201-012™), астроциты крысы (CTX TNA2 (ATCC® CRL-2006)), клетки злокачественной крысиной глиомы линии С6 (ATCC® CCL-107), линии U-87 MG (ATCC® HTB-14) и T-98G (ATCC® CRL-1690) глиобластомы человека, клетки линии МСА-7 аденокарциномы молочной железы (ATCC® HTB-22) и линии A549 (ATCC® CCL-185) карциномы легких человека, первичная культура CD34⁺ ГСК человека (ATCC® PCS-800-012™). Перед началом эксперимента все клетки протестированы на контаминацию микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 30—1012K™).

Для изучения закономерностей миграции СК и выявления некоторых механизмов и особенностей реализации этого феномена выполнен эксперимент in vitro, который проходил в 2 этапа. Задачей первого этапа было выявление особенностей взаимодействия ГСК с опухолевыми и нормальными высокодифференцированными клетками — фибробластами и астроцитами.

Миграция стволовых клеток млекопитающих в сочетанных культурах с клетками различных линий in vitro

Для создания сочетанных культур использовали культуральные вставки с размером пор 12 мкм (Millipore, США). Дно лунок культурального планшета (Grinner BioOne, США) покрывали полиэтиленимином, а затем ламинином (Gibco, США). В каждую лунку планшета помещали пористую культуральную вставку с диаметром пор 12 мкм, которую фиксировали каплей стерильного парафина (рис. 1). Планшет заполняли средой DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, США)) с пониженным содержанием глюкозы и добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 100 U/мл пенициллина (стрептомицина). Все реагенты производства компании Gibco (Thermo Fisher Scientific, Inc., США).

Рис. 1.⠀Схема эксперимента по изучению миграции СК in vitro. А. Общая схема эксперимента. Вставка содержит: 1 — клетки глиомы С6; 2 — астроциты; 3 — фибробласты. Зеленым выделены лунки, которые оставляли пустыми, для оценки пассивной миграции клеток. Б. Схематическое изображение наблюдаемого явления: клетки глиомы линии С6 индуцируют миграцию ГСК, которые формируют вал вокруг и проникают внутрь культуральной вставки

Внутрь вставки вносили 0,5 × 10⁴ клеток глиомы С6, астроцитов или фибробластов, предварительно окрашенных витальным трейсером Vybrant™ CFDA SE CellTracer (кат. № V12883 Invitrogen™). Планшет с культуральными вставками инкубировали в течение 24 ч, затем на дно лунки планшета снаружи культуральной вставки высаживали по 0,5 × 10⁴ ГСК, предварительно окрашенных флуоресцентным маркером CellTracker™ Red CMTPX Dye (кат. № C34552, Invitrogen™).

Клетки культивировали 120 ч (37° C, 5% CO₂). Подсчет клеток, мигрировавших сквозь культуральную вставку, проводили с использованием высокоэффективной количественной микроскопии (Cell-IQ, CM Technologies, Великобритания) с временными отрезками 24—48—72—96—120 ч; регистрировали количество Red CMTPX Dye-позитивных объектов как на границе, так и внутри культуральной вставки. Полученные результаты верифицировали методом цитофлуориметрии.

Спустя 24 ч после начала совместного культивирования наблюдали формирование клеточного вала из флуоресцирующих клеток, располагающихся по периметру культуральной вставки с клетками глиомы. Этот феномен был отчетливо выражен в сокультурах, содержащих опухолевые клетки, и отсутствовал в лунках планшета, где стволовые клетки были совмещены с фибробластами и астроцитами (рис. 2 А—Г).

Рис. 2.⠀Перераспределение ГСК в планшете при совместном

культивировании через 24 ч. А — опухолевые клетки внутри культуральной вставки; Б — сокультура ГСК и фибробластов: формирование вала не наблюдается, увеличение 5x; В — сокультура ГСК и астроцитов: формирование вала не наблюдается, ув. 10x; Г — сочетанная культура ГСК и клеток глиомы С6 — формирование клеточного вала по периметру культуральной вставки, содержащей опухолевые клетки, ув. 5x

В культурах, содержащих опухолевые клетки, ГСК мигрировали сквозь культуральную вставку и визуализировались среди неокрашенных клеток глиомы в форме округлых объектов, отвечающих на воздействие лазера устойчивым флуоресцентным сигналом, регистрируемым в спектре, соответствующем Red CMTPX (577⁄602 нм). В культурах, содержащих фибробласты и астроциты, регистрировались только единичные Red CMTPX-позитивные объекты. В культуральных вставках, оставленных пустыми, выявлялись только солитарные клетки, соответствующие спектру флуоресценции ГСК (табл. 2).

Примечание: данные представлены в виде М ± s.e.m., N = 12 для каждой группы, по каждой точке.

Подсчет числа ГСК, мигрировавших сквозь пористую мембрану или сосредоточенных по периметру культуральной вставки, показал четкое увеличение числа флуоресцирующих элементов в сокультурах, содержащих клетки глиомы, начиная со 2-го по 5-й день эксперимента (рис. 3). Значимых динамических изменений числа ГСК на этапах совместного культивирования культур с астроцитами и фибробластами не наблюдали (рис. 4).

Рис. 3.⠀ГСК человека, мигрировавшие в лунки с глиомой С6.

Окраска CellTracker™ Red CMTPX. Конфокальная микроскопия, флуоресценция при воздействии лазера λ = 546 нм; ув.: об. 10х

Рис. 4.⠀Динамика накопления стволовых клеток в культуральных вставках, содержащих клетки глиомы линии С6, астроциты, фибробласты, и в контрольных вставках. По оси абсцисс — время сокультивирования

(24—48—72—96—120 ч), по оси ординат — число флуоресцирующих клеток во вставке (М ± s.e.m., N = 9 по каждой точке)

Очевидно, направленная миграция ГСК к клеткам глиомы обусловлена продукцией опухолевыми клетками сигнальных молекул. Поскольку в данном эксперименте были использованы клетки крысиной глиомы линии С6, способность ГСК мигрировать в отношении опухолевых клеток человека нуждалась в уточнении.

Очевидно, направленная миграция ГСК к клеткам глиомы обусловлена продукцией опухолевыми клетками сигнальных молекул. Поскольку в данном эксперименте были использованы клетки крысиной глиомы линии С6, способность ГСК мигрировать в отношении опухолевых клеток человека нуждалась в уточнении.

Миграция стволовых клеток человека в сочетанных культурах с клетками злокачественных опухолей различных линий

В данном эксперименте использованы клетки аденокарциномы молочной железы и карциномы легких человека; кроме того, 2 типа клеток глиобластомы: а) клетки общего пула опухоли; б) опухолевые стволовые клетки (ОСК) глиобластомы.

Для получения ОСК клетки глиобластомы культивировались в среде DMEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) без добавления сыворотки, с добавлением L-глутамина (2 мМ), B-27 (0,5 мМ), основного фактора роста фибробластов (20 нг/мл), эпидермального фактора роста (20 нг/мл), пенициллина / стрептомицина (100 ед./мл) и гепарина (5 мкг/мл). ОСК выделяли из глиомасфер на основании экспрессии антигена CD133, используя MicroBead (кат. №130-100-857; Miltenyi Biotec, Inc.). Чистота популяции ОСК, по данным проточной цитометрии (антитела CD133/1-VioBright FITC (кат. №130-105-226; Miltenyi Biotec, Inc.)), составила 96,72%.

Все опухолевые клетки и фибробласты (контроль), используемые в эксперименте, окрашивали Vybrant™ CFDA SE CellTracer, вносили внутрь культуральной вставки в количестве 0,5 × 10⁴. Пространство снаружи культуральной вставки планшета заполняли нейральными прогениторными клетками (НПК) человека (Neural Progenitor Cell Origin ATCC-BXS0117 Normal; Human (ATCC® ACS-5003™)), или ГСК человека в количестве 0,5 × 10⁴. Клетки были окрашены флуоресцентным маркером CellTracker Red CMTPX Dye. Культивирование проводили в течение 120 ч при стандартных условиях. Результаты сравнительного анализа миграционной активности клеток в смешанных культурах представлены на рис. 5.

Нейральные прогениторные клетки (НПК) обладали существенно большей подвижностью при сокультивировании с CD133⁺ ОСК линий U-87 и T98G (+926 и +913,1% от контроля). Аттрактивность НПК в отношении общего пула клеток линий U-87 и U-251 была менее выраженной (+598,7 и +688,8% от контроля) и сопоставима с опухолевыми клетками иного происхождения. ГСК, несколько уступая НПК в способности мигрировать к CD133⁺-клеткам глиобластомы, тем не менее активно мигрировали к этим клеткам (+618,2% к ОСК U-87 и +623,8% к ОСК T98G по сравнению с контролем). Общий пул клеток глиобластомы обладал меньшей аттрактивностью для ГСК (U-87 +449,2% и T98G +523,7% в сравнении с контролем), что сопоставимо с миграцией ГСК к клеткам рака молочной железы (439,2%) и рака легкого (516,8%).

Рис. 5.⠀Количество НПК, ГСК и фибробластов, мигрировавших через культуральную вставку, через 120 ч совместного культивирования. По оси ординат — количество клеток × 10³, данные представлены в виде М ± s.e.m., N = 15 для каждой группы

Обращала внимание выраженная сильная способность глиобластомы привлекать высокодифференцированные клетки — фибробласты. При этом наилучшей подвижностью эти клетки обладали в отношении ОСК (U-87 +897,6% и T98G +889%); клетки общего пула глиобластомы обладали несколько меньшей способностью индуцировать миграцию фибробластов, которая была сопоставима с неопластическими клетками рака молочной железы (380,9%) и легкого (574,9%).

Итак, нейральные прогениторные клетки обладали существенно большей подвижностью к клеткам глиобластомы в сравнении с клетками других типов. Миграционная активность НПК зависела от типа опухолевых клеток в сокультуре, и они более активно мигрировали к ОСК двух типов глиобластомы. Дифференцированные клетки глиобластомы обладали несколько меньшей способностью индуцировать миграцию НПК, однако опухолевые клетки ненейронального происхождения существенно слабее индуцировали процессы миграции нейральных стволовых клеток.

Следует отметить, что по мере приближения ГСК к культуральной вставке и их проникновения внутрь в популяции клеток глиобластомы индуцировалась высокая подвижность. В серии снимков, выполненных в режиме реального времени, с интервалом 3 ч (через 23, 26, 29 и 48 ч после начала эксперимента), видно, что клетки глиобластомы активно передвигались по дну планшета внутри культуральной вставки и как бы собирали мигрирующие к ним ГСК. Через 48 ч наблюдения практически все неопластические клетки были «облеплены» мигрирующими клетками (рис. 6).

Рис. 6.⠀Динамический ряд клеток U-87 глиобластомы в сокультуре с CD34⁺ ГСК. Опухолевые клетки окрашены CellTracker™ Red CMTPX (красный), а ГСК — Vybrant® CFDA SE (зеленый). Стрелкой показана активно перемещающаяся клетка глиобластомы, к поверхности которой адгезируют ГСК. А — 23 ч, Б — 26 ч, В — 29 ч, Г — 48 ч. Флуоресцентная лазерная микроскопия в режиме реального времени. Масштаб 400 мкм

Взаимодействие стволовых клеток человека с клетками злокачественных опухолей in vitro

Способность нормальных стволовых клеток мигрировать и взаимодействовать с опухолевыми клетками требует изучения закономерностей такого взаимодействия. Для ответа на эти вопросы была выполнена серия экспериментов in vitro, в которых использованы клетки глиомы линии С6, глиобластомы линии U-87, клетки аденокарциномы легкого линии А549 и рака молочной железы МСF-7. Для каждой модели выполнены визуальное и цитометрическое изучение процесса взаимодействия ГСК с опухолевыми клетками и автоматизированный мониторинг процесса сокультивирования стволовых и опухолевых клеток в соотношении 3:1; 1:1 и 1:3 в режиме реального времени.

Взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток на модели глиомы линии С6

В рамках подготовки экспериментов 0,5 × 10⁶ клеток глиомы линии С6 после окраски витальным трейсером CFDA SE были внесены в лунки планшета, где инкубировались при стандартных условиях. Спустя 6 ч неприкрепившиеся опухолевые клетки были отобраны и в культуру внесено 0,5 × 10⁶ ГСК, окрашенных флуоресцентным трейсером Red CMTPX. В качестве контроля использовали фибробласты, которые после окраски маркером Red CMTPX вносили в культуру опухолевых клеток в соотношении 1:1.

Через 6 ч клетки линии С6 визуализировались в виде веретеновидных или полигональных образований, отвечающих стойким флуоресцентным сигналом на воздействие лазера (λ = 488 нм). В свою очередь, ГСК при воздействии лазера другого типа (λ = 546 нм) формировали флуоресцентный сигнал, визуализируясь в форме округлых образований (рис. 7 А, Б).

Рис. 7.⠀Флуоресценция сокультивируемых клеток, 6 ч с начала эксперимента in vitro. А — клетки глиомы линии С6, окраска CFDA SE (λ = 488 нм); Б — CD34⁺ стволовые клетки крысы, окраска CMTPX (λ = 546 нм). Флуоресцентная лазерная микроскопия

Спустя 12 ч ГСК адгезировали к клеткам глиобластомы и визуализировались на поверхности клеток глиомы С6 в виде красных флюоресцирующих объектов (рис. 8).

Спустя 24 ч наблюдения в цитоплазме клеток глиомы стали появляться включения красного флуорохрома, что означало присутствие красителя Red CMTPX, ковалентно связанного с белками цитоплазмы ГСК в процессе окраски (рис. 9). Это явление достигало максимума через 48 ч с начала эксперимента, сохранялось до конца исследования и отсутствовало в контрольной культуре с фибробластами.

Рис. 8.⠀Адгезия ГСК (CMTPX, λ = 546 нм) к поверхности клеток глиомы (CFDA SE, λ = 488 нм), 12 ч. Мультифотонная флуоресцентная лазерная микроскопия. ГСК визуализируются в виде цилиндров красного цвета на поверхности клеток глиомы

Рис. 9.⠀Перенос флуоресцентной метки CMTPX из ГСК в клетки линии С6. Флуоресцентная лазерная микроскопия in vitro. Стрелками показано накопление красителя в сокультивируемых клетках

При визуальном наблюдении перенос флуоресцентной метки был заметен в направлении от ГСК к клеткам глиомы, поскольку через 48 ч накопление флуоресцентного красителя CMTPX отмечено именно в цитоплазме клеток линии С6.

Спустя 120 ч контрольная культура опухолевых клеток отвечала на воздействие лазера (λ = 488 нм) устойчивым флуоресцентным сигналом, визуализируя четкую форму клеток глиомы без признаков обмена флуоресцентной меткой с ГСК (рис. 10 А, Б).

Рис. 10.⠀Сокультура ГСК (CMTPX, λ = 546 нм) c клетками глиомы С6 (CFDA SE, λ = 488 нм). А — клетки линии С6 отвечают на воздействие лазеров 2 типов; Б — клетки глиомы отвечают стойким флуоресцентным сигналом на воздействие лазера λ = 488 нм, что свойственно красителю СFDA SE, которым они изначально окрашены. Флуоресцентная лазерная микроскопия, 120 ч эксперимента

Таким образом, при наблюдении взаимодействия 2 популяций совместно культивируемых клеток, окрашенных разными красителями, было обнаружено, что клетки не только мигрируют и адгезируют друг к другу, но и осуществляют перенос флуорохрома в соседние клетки.

Результаты цитологического мониторинга подтверждаются при цитофлуориметрической оценке сокультуры на разных этапах эксперимента (24, 48, 72, 96 ч). Методом проточной цитофлуориметрии показано, что наиболее активное взаимодействие клеток происходит в период 24—48 ч (рис. 11 А, Б), что проявляется накоплением в неопластических клетках флуоресцентной метки.

Число клеток, содержащих двойную окраску, изменяется динамически: через 24 ч в культуре обнаруживается 25,8% дважды меченых клеток, через 48 ч — 40,82%, через 72 ч — 8,75%, через 96 ч — 5,47%. При этом по мере увеличения срока наблюдения тенденция к исчезновению ГСК в смешанной культуре становилась все очевиднее. Так, на 24 ч количество ГСК составляло 47,45%, к 48 ч эксперимента их количество сократилось до 9,01%, критически уменьшилось — к 72 ч (1,18%), а к 96 ч количество ГСК в сокультуре составило 0,73% (рис. 12 В, Г).

Рис. 11.⠀Результаты сокультивирования ГСК (CFDA SE, λ = 488 нм) и глиомы С6 (Red CMTPX, λ = 546 нм) при исходном соотношении клеточных популяций 1:1. (А—+) — клетки, окрашенные CFDA SE, λ = 488 нм; (А+—) — клетки, окрашенные Red CMTPX, λ = 546 нм; (А—) — клетки погибшие либо потерявшие окраску; (А++) — область с клетками, включившими окраску обоими красителями. Для контроля использованы чистые клеточные культуры ГСК и глиомы С6, окрашенные маркерами Red CMTPX, λ = 546 нм и CFDA SE, λ = 488 нм соответственно. А — анализ клеток через 24 ч;

Б — анализ клеток через 48 ч; В — анализ клеток через 72 ч; Г — анализ

клеток через 96 ч

Важно отметить, что в контролях количество клеток глиомы С6 закономерно уменьшалось, что, вероятно, следует объяснить ускоренными темпами пролиферации неопластических клеток, которые постепенно утрачивают флуоресцентную метку. Однако и в сокультуре С6/ГСК количество монопозитивных клеток линии С6 уменьшается, при этом монопозитивных клеток на 96 ч эксперимента в сокультуре с ГСК значительно меньше, чем в контроле. Сказанное выше свидетельствует в пользу переноса флуоресцентной метки из ГСК в опухолевые клетки на ранних сроках сокультивирования (до 48 ч). При этом на более поздних сроках (48—96 ч) клетки глиомы особенно интенсивно накапливали флуоресцентную метку от ГСК. Важно отметить, что в ходе сокультивирования популяция клеток ГСК практически исчезла на поздних сроках (120 ч).

Для изучения эффектов взаимодействия ГСК с опухолевыми клетками интеллектуальная система мониторинга Cell-IQ была настроена на распознавание образов и подсчет числа живых и мертвых клеток в режиме реального времени. Под живыми клетками понималась итоговая сумма образов интерфазы и митоза (2).

Рис. 12.⠀Образы опухолевых клеток по данным системы Cell-IQ.

А — адгезировавшие клетки; Б — неадгезировавшие пролиферирующие клетки (в т.ч. с признаками ранней профазы); В — мертвые клетки

Термином «пролиферирующие» были обозначены клетки, обнаруживающие прекращение функциональной активности, имеющие отчетливые признаки открепления от субстрата и характеризующиеся увеличением объема ядра и клетки в целом, округлыми контурами клеточной мембраны и светлой цитоплазмой с отсутствием патологических включений, а также другими морфологическими признаками ранней профазы. При подсчете пролиферирующих клеток также учитывались клетки, находящиеся в митозе.

Динамическое наблюдение числа опухолевых клеток, сокультивируемых с ГСК, показало зависимость антипролиферативного эффекта от соотношения внесенных в культуру клеток. К концу эксперимента кривая нарастания числа живых клеток в сокультуре С6/ГСК при соотношении 3:1 не обнаруживала значительных отличий от контрольной культуры клеток линии С6 (рис. 13).

Рис. 13.⠀Результаты сокультивирования клеток линии С6 с ГСК. По оси абсцисс — время эксперимента (ч), по оси ординат — количество клеток линии С6 в сокультурах с ГСК. Данные приведены в виде М ± s.e.m., n = 30 по каждой точке. Знаком * показаны достоверные (p <0,05) различия в количестве клеток линии С6 в сокультуре с ГСК/C6 в соотношении 1:1 и знаком ** в соотношении 3:1 по сравнению с контрольной

культурой С6

При сокультивировании клеток линии С6/ГСК в соотношении 1:1 и более к 120 ч эксперимента сократилось как общее число опухолевых клеток, так и количество пролиферирующих клеток, определяемых с помощью иммуноцитохимической окраски на PCNA (рис. 14).

При сокультивировании с клетками глиомы С6 в соотношении 1:1 ГСК оказывали на них цитостатический эффект. При увеличении количества ГСК в сочетанной культуре до 1:3 этот эффект был более очевидным, что свидетельствует о способности ГСК подавлять пролиферацию опухолевых клеток in vitro, зависящей от числа внесенных стволовых клеток (рис. 15).

Рис. 14.⠀Количество PСNA-позитивных клеток в сокультурах глиомы С6/ГСК в ходе эксперимента. А — 18 ч, Б — 36 ч, В — 54 ч, Г — 72 ч. По оси ординат указано количество пролиферирующих клеток, % от общего числа клеток в сокультуре. Данные приведены в виде среднего ± стандартное отклонение), n = 18 по каждой точке. Знаком * показаны достоверные (p <0,05) отличия между числом PCNA-позитивных клеток в сокультуре С6/ГСК в соотношении 1:3 в сравнении с контролем. Различия особенно очевидны на сроке 72 ч

Таким образом, совместное культивирование ГСК с клетками глиомы линии С6 сопровождается адгезией ГСК к опухолевым клеткам, взаимодействием с ними, развитием антипролиферативного эффекта, при этом противоопухолевый потенциал таких взаимодействий возрастает по мере увеличения количества стволовых клеток в анализируемой системе.

Рис. 15.⠀Динамика количества клеток линии С6 при сокультивировании с ГСК по данным высокоэффективной количественной микроскопии в реальном времени. Сокультивирование клеток С6/ГСК: А — 1:3, Б — 1:1, В — 3:1. В качестве контроля использована культура фибробластов; по оси абсцисс — время в ч, по оси ординат — количество клеток, млн. Данные приведены в виде среднего ± стандартное отклонение), n = 18 по каждой точке. Б, Г, Е — указано распределение клеток глиомы С6 на 117 ч наблюдения в соответствующих сокультурах по данным Сell-IQ

Взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток с клетками злокачественных опухолей человека

Во второй части эксперимента изучалось in vitro взаимодействие ГСК человека с клетками линии U-87 глиобластомы человека, линии А549 рака легких человека и линии MCF-7 рака молочной железы человека. Спустя 24 ч наблюдений отмечали адгезию ГСК к поверхности опухолевых клеток различных линий (рис. 16).

Рис. 16.⠀Адгезия ГСК (окраска CFDA SE, λ = 488 нм) к поверхности опухолевых клеток: А — рака легких, Б — аденокарциномы молочной железы, В — глиобластомы (окрашены CMPTX, λ = 546 нм); Г — cокультура фибробластов человека и ГСК, признаки адгезии отсутствуют. Флуоресцентная лазерная микроскопия, 24 ч эксперимента. Соотношения клеток 1:1. Масштаб 400 мкм

Спустя 48 ч в цитоплазме опухолевых клеток стали проявляться включения зеленого флуоресцентного красителя CFDA SE, которым предварительно были окрашены ГСК. Признаки обмена флуоресцентной меткой были заметны во всех сокультурах, однако особенно очевидны в сокультуре ГСК с клетками рака легких А549/ГСК (рис. 17).

Рис. 17.⠀Накопление зеленой флуоресцентной метки в клетках рака легких линии А549 (изначально окрашены витальным трейсером Red CMPTX; λ = 546 нм, красный) при сокультивировании с ГСК (СFDA SE; λ = 488 нм, зеленый), 48 ч эксперимента. Лазерная сканирующая микроскопия в реальном времени. Масштаб 400 мкм

Описанный феномен был выражен среди всех линий опухолевых клеток и визуализировался с использованием мультифотонной микроскопии, что позволяет отличить транспорт флуоресцентной метки от возможного свечения ГСК, распластавшихся по поверхности опухолевых клеток. На данном сроке эксперимента транспорт флуоресцентной метки проходил только в направлении из ГСК в опухолевые клетки, однако c увеличением времени до 48—72 ч в спектре свечения ГСК, адгезировавших к поверхности клеток глиобластомы, начинали преобладать желтые тона (рис. 18, 19), что отчасти может быть связано с пересечением спектров флуоресцентного сигнала, отраженного от окрашенных SFDA (λ = 488 нм), и распластавшихся по их поверхности ГСК, окрашенных красителем Red CMTPX (λ = 546 нм).

Рис. 18.⠀Взаимодействие ГСК с опухолевыми клетками при сокультивировании в соотношении 1:1 в течение 48 ч. 1 — появление оранжево-желтого оттенка в цитоплазме ГСК, которые адгезировали к клеткам глиобластомы линии U-87. Неопластические клетки изначально окрашены витальным трейсером CMPTX (λ = 546 нм, красный), ГСК — СFDA SE (λ = 488 нм, зеленый); 2 — при этом как на поверхности, так и, возможно, в цитоплазме (указано стрелкой) клеток глиобластомы отчетливо заметны флуоресцентные тельца диаметром значительно меньше ГСК. Флуоресцентная лазерная микроскопия. Масштаб 600 мкм

Рис. 19.⠀Взаимодействие ГСК с опухолевыми клетками при сокультивировании в соотношении 1:1 в течение 72 ч. А — (1) накопление оранжево-желтого оттенка в цитоплазме ГСК, которые адгезировали к клеткам глиобластомы линии U-87. Неопластические клетки изначально окрашены витальным трейсером CMPTX (λ = 546 нм, красный), ГСК — СFDA SE (λ = 488 нм, зеленый); (2) на поверхности клеток глиобластомы видны флуоресцентные тельца диаметром значительно меньше ГСК. Б — взаимодействие ГСК (1) с клетками глиобластомы (2). Флуоресцентная лазерная микроскопия. Масштаб 600 мкм

Анализ спектра флуоресценции ГСК, адгезировавших к поверхности клетки глиобластомы, свидетельствует об увеличении в нем количества оранжево-желтых оттенков, что может быть связано с присутствием в ГСК красителя Red CMTPX, привнесенного из клеток глиобластомы в процессе межклеточного взаимодействия. Отметим, что с увеличением срока культивирования признаки переноса флуоресцентной метки не только из ГСК в ОК и наоборот были отмечены во всех сокультурах, но в контрольной культуре такие феномены зарегистрированы не были. По результатам ЦФМ, через 24 ч в сокультуре А549/ГСК регистрировалось 9,6 ± 1,3% клеток, позитивных по 2 красителям (рис. 20).

Через 36 ч совместного культивирования число дважды позитивных клеток возрастало до 13,3 ± 0,8%. Через 48 ч с момента начала исследования число дважды позитивных клеток достигло 27,4 ± 1%, а к 96 ч наблюдения количество таких клеток увеличилось до 77,5 ± 4%. Важно отметить, что параллельно увеличению количества дважды позитивных клеток уменьшалось число монопозитивных ГСК. По данным программы Kaluza, увеличение числа дважды позитивных клеток происходило за счет клеток линии А549 (табл. 3).

Примечание: данные представлены в процентах от общего числа клеток каждой группы, в М ± s.e.m., n = 9 по каждой точке. * — число дважды позитивных опухолевых клеток через 48 ч наблюдений; достоверно (p <0,05) отличается от количества дважды позитивных ГСК.

Рис. 20.⠀Гистограммы распределения клеток в сокультуре рака легких с ГСК по данным цитофлуориметрии c использованием флуоресцентных красителей: 36 ч с начала эксперимента; А1, Б1, В1, Г1 — клетки рака легкого, контроль; А2, Б2, В2, Г2 — гемопоэтические стволовые клетки, контроль; А3, Б3, В3, Г3 — сокультура ГСК с клетками рака легкого линии А549

Рис. 21.⠀Гистограммы распределения в сокультуре клеток рака молочной железы и глиобластомы с ГСК по данным цитофлуориметрии c использованием флуоресцентных красителей: А1 — клетки рака молочной железы линии MCF-7, контроль; А2 — гемопоэтические стволовые клетки, контроль; А3 — сокультура ГСК с клетками рака молочной железы линии MCF-7; Б1 — клетки глиобластомы линии U-87, контроль; Б2 — гемопоэтические стволовые клетки, контроль; Б3 — сокультура ГСК с клетки глиобластомы линии U-87

В свою очередь, уменьшение числа монопозитивных стволовых клеток может быть связано с гибелью части популяции ГСК под токсическим воздействием нарастающего количества продуктов жизнедеятельности неопластических клеток. Существенное увеличение количества дважды позитивных клеток наблюдалось к 96 ч эксперимента и в других сокультурах. Так, число клеток, позитивных в отношении 2 красителей, составляло 47,5% в сокультуре ГСК с клетками MCF-7 и 64,3% в сокультуре ГСК с клетками глиобластомы (рис. 21). При этом в сокультуре ГСК с клетками глиобластомы к концу эксперимента практически не осталось монопозитивных ГСК.

Обсуждение полученных данных

Как следует из данных эксперимента in vitro, стволовые клетки обладают подвижностью по отношению к клеткам других типов, которая особо выражена по отношению к опухолевым клеткам. В свою очередь, миграционная активность СК нейрального и ненейрального происхождения сильно различается по отношению к опухолевым клеткам нейроглиального и ненейроглиального рядов. Очевидно, данный факт иллюстрирует собой важную закономерность: стволовые и опухолевые клетки, полученные из одного источника, обладают максимальной степенью аттракции в отношении друг к другу. Этот факт хорошо иллюстрирует высокая подвижность клеток глиобластомы в пределах культуральной вставки по направлению к стволовым клеткам, мигрирующим сюда сквозь ее поры.

Однако заслуживает особого внимания тот факт, что подвижность НПК в отношении различных типов клеток линии глиобластомы тоже совсем неодинакова. Так, дифференцированные клетки 2 типов глиобластомы в 5 и 6 раз соответственно превосходят их подвижность в контроле, однако миграционная активность этого НПК в отношении ОСК превосходит контроль практически на порядок.

Высокая подвижность НПК по отношению к различным типам опухолевых клеток не является неожиданностью. Способность к непрерывной миграции из первичных герминативных зон головного мозга — одно из важнейших свойств нейральных стволовых клеток (Ярыгин, 2015; Aboody et al., 2013) и их прямых потомков — нейральных прогениторных клеток (Benedetti, 2000). Мигрируя из субвентрикулярной зоны головного мозга, потоки НСК ориентируются по градиенту концентрации сигнальных молекул (Doetsch et al., 1999), продуцируемых эндотелием кровеносных сосудов, что позволяет провести параллели. Периваскулярный способ инвазии клеток МГБ также характеризуется миграцией опухолевых элементов по пространствам Вирхова — Робина, а также распространением вдоль пенетрирующих паренхиму мозга артерий, артериол и вен. В этой связи аргументом в пользу единства механизмов, определяющих специфические взаимоотношения НПК и ОСК, являются указания на способность растущей в мозге МГБ опустошать первичные герминативные центры мозга, что довольно подробно проиллюстрировано в работах Najbauer (2012), Walzlein (2008), Ярыгина (20015), Цимбалюка (2005) и других авторов.

Данное обстоятельство свидетельствует в пользу наличия прямой связи ОСК глиобластомы и нормальных СК головного мозга человека и высших млекопитающих и, конечно, служит весомым аргументом, позволяющим рассматривать СК как важный фактор патогенеза глиом. Нельзя исключить, что способность опухоли привлекать СК наводит на мысль, что запуск и поддержание миграционной активности опухолевых клеток в значительной мере обеспечивается субпопуляцией стволовых клеток.

Относительно слабая способность культур клеток линии МСА-7 рака молочной железы и А549 рака легкого привлекать СК не должна вводить в заблуждение. Рак молочной железы — гормонально зависимая опухоль, которая по распространенности и масштабу летальности уступает только раку легких, лидирующему в общемировой статистике онкологической смертности. Не исключено, что способность привлекать стволовые клетки может быть связана с многочисленными пассажами этих линий in vitro, приводящими к потере ряда важных сигнальных механизмов. В свете сказанного обращает на себя внимание тот факт, что НПК проявляли максимальную тропность в отношении опухолей нейроэпителиального происхождения и значительно уступали ГСК в активности по направлению к опухолям иного тканевого происхождения.

ГСК, несколько уступая НПК в способности мигрировать в направлении клеток злокачественных опухолей, тем не менее активно мигрировали к неопластическим клеткам. Этот факт согласуется с данными литературы, указывающими на высокую подвижность стволовых клеток костного мозга в отношении различных линий опухолевых клеток (Nakamizo et al., 2005; Кирик и др., 2013). Их миграционные возможности немногим уступают НПК и демонстрируют принципиальные различия в этой способности с дифференцированными клетками. Нельзя не отметить, что по способности привлекать ГСК сепарированные CD133⁺-клетки существенно превосходят другие клетки МГБ, что также является аргументом в пользу уже высказанного предположения, что в составе популяции клеток опухоли именно ОСК обеспечивают максимальный вклад в подачу специфического сигнала, запускающего процессы миграции ГСК и клеток других типов. Следуя этой логике, можно предполагать, что онкотехнологии, основанные на создании модифицированных СК, способны обеспечить эффективное управление судьбой опухолевых стволовых клеток.

СК обладают способностью направленно мигрировать к опухолевым клеткам, но роль этого феномена в канцерогенезе МГБ практически не изучена. Идентифицировано множество хемоаттрактантов, факторов роста и других сигнальных молекул, управляющих процессами миграции и хоуминга стволовых клеток, о чем сказано ранее. Однако роль указанных выше механизмов в патогенезе глиальных опухолей головного мозга пока описана не полностью.

Как следует из эксперимента, первичным источником сигнальных молекул, привлекающих СК, являются клетки опухоли. Способность клеток МГБ продуцировать коллаген IV типа, лектины и тенасцин доказана. Продукция клетками МГБ матриксных металлопротеаз (MMP1, 2 и 9) способствует разрушению внеклеточного матрикса (ВКМ) и высвобождению фибронектина, витронектина и ряда других молекул, резко повышающих мотильность опухолевых клеток и их способность привлекать стволовые и дифференцированные клетки. Рекрутируя микроглиоциты, астроциты и эндотелиальные клетки, МГБ индуцируют продукцию металлопротеаз, что усиливает процессы деградации ВКМ. Поскольку инвазивные свойства МГБ ассоциированы именно с ОСК, то наблюдаемая в эксперименте лучшая подвижность ГСК и НПК относительно ОСК позволяет предположить, что способность привлекать СК не только находится в зависимости от инвазивного потенциала опухоли, но и усиливается в процессе реализации этого потенциала.

Таким образом, в эксперименте in vitro изучены процессы направленной миграции СК к ОК различных типов. Установлено, что способность мигрировать к опухолевым клеткам в большей степени свойственна именно тканеспецифическим нейральным прогениторным клеткам. Наилучшей способностью индуцировать миграцию СК обладают ОСК, что свидетельствует о прямой зависимости этого феномена от инвазивного потенциала опухоли. Вектор миграционной активности более выражен между клетками, имеющими единый гистогенетический источник.

ГСК обладают выраженной способностью к миграции в отношении клеток глиальных опухолей. В свою очередь, клетки глиобластомы линии также обладают высокой степенью мобильности и активно перемещаются в поле зрения, «собирая» стволовые клетки. На принципиальное значение адгезии стволовых и опухолевых клеток указывали Greenbaum (2013), Pittenger (2008), Sohin (2003) и ряд других авторов, отметивших принципиальную возможность колаборации между ними. При этом важно, что ГСК не являются сугубо адгезионной культурой и выявленная нами и описанная в литературе способность СК этого типа адгезировать к клеткам злокачественных опухолей является важным условием, определяющим их роль в опухолевом процессе.

Мысли о противоопухолевых свойствах ГСК высказываются более 50 лет, однако механизмы этого явления неясны. Показана способность ГСК подавлять процессы роста клеток рака поджелудочной, предстательной желез и ряда некоторых линий меланомы, клеток первичного лейкоза, саркомы Капоши, гепатомы и рака молочной железы. В качестве механизмов этого феномена указывается подавление CD34⁺-клетками процессов сигнальной трансдукции по внутриклеточному пути MAPK и особая роль активизации ГСК лиганд-рецепторных осей CXCR4/SDF, VLA4/VCAM1, CD62L/PSGL, CD44/HA b Kit/KL (Nervi et al., 2006) в опухолевых клетках. Высказывается мнение, что активное привлечение ГСК в опухолевый очаг, осуществляемое через активацию этих сигнальных механизмов, имеет целью трансформацию их в резидентные макрофаги с последующей презентацией опухолевых антигенов (Ratajczak et al., 2003; Sainathan et al., 2008). Как показано в литературе, адгезия ГСК к поверхности клеток опухоли (Sahin et al., 2012) снижает степень их мобильности, подавляя индуцированный TGF-β-синтез компонентов межклеточного матрикса и препятствуя метастазированию (Xiang et al., 2015).

Важной особенностью процесса коммуникации ГСК с клетками опухолей является перенос флуоресцентной метки между ними. В настоящей работе использовались красители на основе сукцинимидного эфира 5,6-карбоксилфлуоресцеин диацетата, обладающего липофильными свойствами, благодаря чему они легко проникают сквозь клеточную мембрану в процессе окрашивания. В цитоплазме клетки молекула красителя ковалентно взаимодействует с аминогруппами цитоплазматических белков (Rahman et al., 2015), благодаря чему метка не высвобождается из клеток и приобретает способность флуоресцировать. Это позволяет рассматривать сущность выявленного в настоящем фрагменте работы феномена переноса флуоресцентной метки именно как трансфер цитоплазматических белков, неразрывно связанных с клеточным красителем. При этом транспорт белков происходит преимущественно между ГСК и опухолевыми клетками разных линий, что, очевидно, представляет собой закономерность межклеточного взаимодействия в данной системе.

Особый интерес представляют механизмы данного явления. Существуют данные о возможности клеточной фузии, или слияния стволовой и неопластической клеток (Чумасов и др., 2010). Этот механизм играет важную роль в регуляции стволовыми клетками процессов детерминации, индукции и дифференциации, коррекции нарушений в поврежденных клетках, репарации и регуляции фенотипа стволовых клеток костного мозга (Wurmser et al., 2002).

Обмен флуоресцентной меткой возможен через экзосомы (Xu et al., 2015), в пользу чего свидетельствует наличие большого количества флуоресцирующих объектов мелкого размера существенно меньше диаметра ГСК. Обмен экстрацеллюлярными везикулами с белками и микроРНК возможен также через особые дифференцировки цитоплазмы — наноразмерные микротрубки (Godlewski et al., 2015), образуемые между мембранами взаимодействующих клеток, либо путем формирования структурно-функционального синцития между стволовыми и опухолевыми клетками.

В ходе эксперимента при взаимодействии стволовых и опухолевых клеток мы наблюдали рад принципиальных моментов. Так, способность ГСК к подавлению ключевых функций опухолевых клеток носит дозозависимый характер, что в известном смысле объясняет конечный биологический смысл их миграции в опухолевую ткань. Резонно предположить, что существенная разница между количеством СК в молодом и пожилом возрасте является одной из причин преобладания злокачественных опухолей во 2-й половине жизни.

При сокультивировании ГСК и опухолевых клеток различных типов в соотношении 1:1 становится возможным описать другие принципиальные закономерности. Клетки рака легкого преимущественно накапливают флуоресцентную метку (цитоплазму), привнесенную из ГСК, что, вероятно, является одним из механизмов противоопухолевого действия этого типа клеток. Во втором случае при культивировании ГСК с клетками линии U-87 и MCF-7 наблюдается увеличение количества дважды позитивных клеток при снижении количества ГСК. При этом важно, что к 96 ч наблюдений в сокультуре ГСК с клетками глиобластомы практически не остается стволовых клеток, позитивных только в отношении одного из используемых красителей.

Механизмы данного феномена нуждаются в дальнейшем изучении, однако, исходя из данных эксперимента, нельзя исключить, что специфика наблюдаемых феноменов отражает именно принципиальное существо взаимодействия между клетками данного типа. Так, направленная миграция ГСК к клеткам глиобластомы резко усиливается при активизации различного типа рецепторов лигандами, продуцируемыми как зоной повреждения, так и самими опухолевыми клетками. В ответ на эти стимулы ГСК мигрируют к опухолевым клеткам и адгезируют к ним. Безусловно, это явление носит регуляторный характер, но в процессе взаимодействия с неопластическими клетками ГСК подвергаются воздействию различных протеолитических ферментов, продуцируемых клетками опухоли. С одной стороны, такое воздействие запускает в них процессы апоптоза, что проявляется накоплением в цитоплазме соответствующих белков, с другой — позволяет опухолевым клеткам фагоцитировать фрагменты разрушенных клеток. Весьма вероятно, что накопление в опухолевых клетках проапоптотических и других белков вызывает серьезные сдвиги в эпигенетической регуляции экспрессии генов, что ведет к торможению пролиферации и угнетению жизненных функций опухолевых клеток. Именно при следовании этой логике становится понятным наблюдаемый нами дозозависимый противоопухолевый эффект ГСК.

Таким образом, при совместном культивировании гемопоэтические CD34⁺ стволовые клетки адгезируют к клеткам злокачественных опухолей, что сопровождается переносом цитоплазматического содержимого из ГСК в опухолевые клетки. Этот феномен наблюдается у 31% клеток глиомы линии С6, у 47% клеток рака легкого А549 и аденокарциномы молочной железы и у 64% клеток линии U-87 глиобластомы человека. Увеличение соотношения в системе «опухолевые клетки / ГСК» в сокультуре сопровождается замедлением темпов пролиферации опухолевых клеток.